FPLC 단백질 분리정제(액체크로마토그래피) 파악하기 - 첫번째 레진 특성과 종류

단백질 분리정제는 반드시 Chromatography  실험을 해야 합니다.

 

단백질은 분자량, 전하(등전점, PI), 소수성, 생리활성, 화학적 결합성 등에 있어서 각기 다르며, Chromatography란 분석기기를 이용해서 분리를 하는 것을 말합니다.

 

Chromatography는 Chroma (색)과 graph (그림)을 어원으로 만든 단어로 러시아 학자가 엽록소를 분리하면서 이름이 명명되었으며, 

지금의 액체 크로마토그래피는 중력 방식과 시스템을 이용한 방식으로 나뉘며, 시스템을 이용한 분리 정제는 보다 확실한 정제와 더불어 다양한 모니터링이 가능하다는 장점이 있습니다.

 

또한 연구용과 생산용 두 가지로 구분되어 유속이나 압력 등 여러 가지 성향으로 목적에 따라 구분할 수 있습니다.

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크로마토그래피 컬럼, 레진(Columns, Resin)?

단백질 분리정제를 하기 위해선 반드시 필요한 부분이 레진입니다.

 

이 레진은 각각의 성향에 따라 단백질 분리할 수 있는 능력이 달라지며 각각의 스텝에 따른 단백질 분리를 하여 원하는 타깃 단백질을 얻을 수 있게 됩니다.

 

단백질 크로마토그래피 분리 방법은 여러 가지 방식으로 분리가 가능하나 크게 4가지로 구분할 수 있습니다.

항체 정제를 할 수 있는 Affinity(어피니티), Ion exchange(이온교환), Gel filtration(여과분리), Desalting(탈염)으로 구분할 수 있습니다.  

 

타겟 단백질의 특성에 따라 분리를 하거나, 재조합 단백질을 만들기 위하여 분리 과정을 거칠 수 있습니다.

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정제 방법과 순서

생체 물질에는 핵산, 단백질, 지질 등 여러 종류가 있습니다.

 

앞서 말씀드린 단백질 정제 관련하여 공정에 필요한 샘플의 볼륨과 순도를 고려하여 3단계로 나누어 정제를 진행하여 최대한의 높은 퀄리티의 샘플을 얻는 것에 목적을 두고 실험을 해야 합니다.

 

초기 시작되는 샘플의 경우 샘플 양이 많고 여러 종류의 단백질이 혼합되어 있어, 목적 단백질을 분리하기 위하여는 초기 정제가 우선적으로 중요 합니다.

 

따라서 초기 필요 단계에서 높은 처리량과 단시간에 정제가 가능한 어피니티, 이온교환 크로마토그래피 정제를 추천드립니다.

최종 정제 단계에서는 겔여과 크로마토그래피 즉 size 분리를 하여 순도를 높일 수 있는 정제를 통하여 최종적으로 원하는 단백질을 얻을 수 있게 됩니다.

 

물론 목적이 무엇을 정제하느냐에 따라 순서는 바뀔 수 있으니 이론적인 부분과 실제로 정제는 차이가 있을 수 있습니다.

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레진 선택 방법

초기 정제

목적 - 단시간 처리가 필수 항목으로 농축, 안정화, 소분화의 포커스로 레진을 선택해야 합니다.

 

특성 - 샘플 중에 불순물이 많기 때문에 유속 특성이 뛰어난 레진이 적합합니다.

 

추천 레진 - 어피니티(Affinity), 이온교환(ion exchange)

 

추천 레진 입자 직경 - 90 ~ 200 µm

 

중간 정제

목적 - 초기와 비슷하지만 최대 목적은 불순물 제거와 농축, 버퍼 교환을 하기 위한 목적을 갖고 있는 것으로 선택합니다.

 

특성 - 초기 정제와 중간 크기 입자 직경을 가진 레진을 주요 사용하여 보다 신속한 분리정제를 할 수 있는 레진이 적합합니다.

 

추천 레진 - 이온교환(ion exchange), 탈염 및 버퍼교환(desalting), 어피니티(affinity)

 

추천 레진 입자 직경 - 30 ~ 90 µm

 

최종 정제

목적 - 구조적 불순물과 미량의 불순물을 제거하여 높은 순도의 샘플을 얻기 위한 단계이며 다소 초기 중기보다 높은 압력과 시간이 오래 걸리는 부분이 있습니다.

 

특성 - 분리 능력을 중시하며, 미세한 입자 직경의 레진을 선택

 

추천 레진 - 겔여과 (gel filtration)

 

추천 레진 입자 직경 - ~30 µm

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총정리

각 정제 단계의 목적에 맞는 레진 선택이 중요하며, 레진 특성 중에서도 특히 입자 직경에 초첨을 맞춰 입자가 커다란 쪽이 낮은 압력으로 빠르게 분리할 수 있는 초기 단계 선택

 

레진의 입자가 작은 사이즈를 선택하여 높은 압력으로 천천히 샘플을 분리하여 최종적으로 순도 높은 샘플을 얻을 수 있는 방식으로 구분하여 정제를 하는 순으로 구분되고,

목적에 따라 어플리케이션 순서를 변경할 수 있으나 초기 중기에 크기분리 즉 gel filtration 정제는 시간과, 레진 손상, 단백질 샘플 손상 등 불리한 조건이 많기 때문에 추천드리고 싶은 단계 선택은 아닙니다.

 

보다 자세한 설명 또는 상담이 필요할 경우 아래 문의로 연락 주시면 자세하게 설명드리도록 하겠습니다.

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